メラノタンIの固相合成法

背景

アファメラノチドとしても知られるメラノタン I は、13 個のアミノ酸で構成される直鎖状ポリペプチドであり、製薬研究においてますます重要な役割を果たす態勢が整っています。メラノタン I の主な英語名は Melanotan-1 および Afamelanotide です。 α-メラノサイト刺激ホルモン α-MSH) の合成類似体として、メラノタン I は赤血球生成性プロトポルフィリン症によって引き起こされる光線過敏症の治療に使用できます。現在、ほとんどのメラノタン I 製品には研究用途のみがラベル付けされており、人間への応用はまだ意図されていません。従来の固相合成では、樹脂の選択がカップリング効率と生成物の最終純度に大きな影響を与えます。

基本情報

中国名：メラノタン1
英語名: メラノタン-1
社内番号：GT-A006
CAS番号: 75921-69-6
シーケンス: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
分子式: C78H111N21O19
分子量: 1646.88

 準備方法

私。 Fmoc-Val-アミノ樹脂の調製

ステップ 1:置換度 0.45 mmol/g の Ramage Amide AM 樹脂 11.11 g (5 mmol) を秤量し、固相反応器に加えます。 DCM を加えて樹脂を 30 分間膨潤させた後、水を切ります。 DMFで3回洗浄します。 20% ピペリジン (v/v) を含む DMF 溶液を加え、5 分間反応させます。さらに 20% ピペリジン DMF 溶液を加え、間に 1 回 DMF 洗浄を挟みながら 10 分間反応させます。反応が完了したら、水を排出し、DMF で 3 回洗浄します。

ステップ 2:5.09gのFmoc-Val-OH、2.02gのHOBT（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール）、および2.32mlのDIC（N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド）を0℃でDMFに溶解します。完全に溶解した後、混合物を反応カラムに加え、室温で 1 時間反応させます。ニンヒドリン検査を使用して反応の進行を監視し、結果が陰性であることを確認します。反応が完了した後、DMF で 3 回洗浄し、Fmoc-Val-アミノ樹脂を取得します。

II. メラノタンの完全に保護された樹脂ペプチドの調製 I.

ステップ 1:20% ピペリジンの DMF 溶液 (体積比) を上記の Fmoc-Val-アミノ樹脂に加えます。 ５分間反応させた後、さらに２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を加え、１０分間反応させた。インターバル中に DMF で 1 回洗浄します。反応が完了した後、真空下で乾燥し、DMFで3回洗浄します。

ステップ 2:5.06gのFmoc-Pro-OH、2.02gのHOBT（1-ヒドロキシベンゾトリアゾール）、および2.32mlのDIC（N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド）を0℃でDMFに溶解します。完全に溶解した後、混合物を反応カラムに加え、室温で 1 時間反応させます。陰性結果が得られるまで、ニンヒドリン テスト (カイザー テスト) を使用して反応の進行を監視します。完了したら、DMF で 3 回洗浄して、Fmoc-Pro-Val-アミノレジンを取得します。

ステップ 3:ステップ 2 に記載の方法に従って、メラノタン I の配列に従って各アミノ酸を順次結合します。 Ac-Ser(tBu)-OH 結合反応の完了後、DMF で 3 回、DCM (ジクロロメタン) で 3 回、メタノールで 3 回洗浄します。真空下で乾燥させて、完全に保護されたメラノタン I 樹脂結合ペプチド 23.89 g を取得します。

Ⅲ． メラノタン I 粗ペプチドの調製
完全に保護されたメラノタン I 樹脂結合ペプチド 23.89 g を丸底フラスコに入れた。 ０℃で、予め調製した切断カクテル（体積比でＴＦＡ：チオアニソール：フェノール：トリイソプロピルシラン：水＝８２．５：７．５：５：３：２から構成される）２５０ｍｌを撹拌しながらゆっくり加えた。混合物を低温で０．５時間反応させた後、室温で２時間反応させた。次いで、切断溶液を真空濾過した。この溶液を、撹拌しながら２Ｌの氷冷した無水ジエチルエーテルにゆっくりと加えた。粗ペプチドを濾過により単離し、氷冷ジエチルエーテルで３回洗浄し、８．５５ｇのメラノタンＩ粗ペプチドを得た。

IV. メラノタン I 精製ペプチドの調製
ステップ 1:粗メラノタンＩペプチドを１００ｍｌの精製水に溶解し、０．４５μｍの膜で濾過して粗ペプチド溶液を得る。

ステップ 2:高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用して、粗メラノタン I ペプチドを精製します。移動相 A (0.05% トリフルオロ酢酸水溶液) および移動相 B (アセトニトリル中の 0.05% トリフルオロ酢酸) を備えた DAC-HB50 動的軸圧縮カラムを使用します。分離精製にはグラジエント溶出を行います。 UV 検出器を使用してサンプルを検出し、目的のピークに対応するペプチド溶液を分画で収集します。

ステップ 3:ＨＰＬＣ精製後、９９％を超える純度のメラノタンＩトリフルオロ酢酸溶液１８０ｍｌを得る。ロータリーエバポレーションにより溶液を５０ｍｌまで濃縮する。

ステップ 4:クロマトグラフィーカラムを脱イオン水で平衡化し、精製したメラノタン I トリフルオロ酢酸溶液 (純度 >99%) 50 ml をロードします。 2%酢酸水溶液系で50分間溶出する。収集した目的生成物をロータリーエバポレーターで 80 ml まで濃縮します。予備凍結乾燥および凍結乾燥を実行して、最終的に 5.33 g の Melanotan I 精製ペプチドを収率 32.33% で得ます。