ペプチドは、ペプチド結合を介した複数のアミノ酸の結合によって形成される化合物の一種です。それらは生物のいたるところに存在します。これまでに、数万のペプチドが生体中で発見されています。ペプチドは、さまざまなシステム、器官、組織、細胞の機能活性の制御や生命活動に重要な役割を果たしており、機能解析、抗体研究、創薬などの分野でよく使用されています。バイオテクノロジーとペプチド合成技術の発展に伴い、ますます多くのペプチド医薬品が開発され、臨床で応用されています。
ペプチド修飾には多種多様なものがあり、簡単に後修飾とプロセス修飾（派生アミノ酸修飾を利用する）に分けられ、N末端修飾、C末端修飾、側鎖修飾、アミノ酸修飾、骨格修飾、など、修飾部位に応じて異なります（図1）。ペプチド鎖の主鎖構造または側鎖グループを変更する重要な手段として、ペプチド修飾はペプチド化合物の物理的および化学的特性を効果的に変更し、水溶性を高め、生体内での作用時間を延長し、生体内分布を変更し、免疫原性を排除することができます。この論文では、いくつかの主要なペプチド修飾戦略とその特徴を紹介します。
1. 環化
環状ペプチドは生物医学に多くの用途があり、生物学的活性を持つ天然ペプチドの多くは環状ペプチドです。環状ペプチドは直鎖状ペプチドよりも硬い傾向があるため、消化器系に対して非常に耐性があり、消化管内で生存することができ、標的受容体に対してより強い親和性を示します。環化は、環状ペプチド、特に大きな構造骨格を持つペプチドを合成する最も直接的な方法です。環化様式により、側鎖－側鎖型、末端－側鎖型、末端－末端型（エンドツーエンド型）に分けられる。
(1) サイドチェーンからサイドチェーンへ
側鎖間の環化の最も一般的なタイプは、システイン残基間のジスルフィド架橋です。この環化は、一対のシステイン残基が脱保護され、その後酸化されてジスルフィド結合を形成することによって導入されます。多環式合成は、スルフヒドリル保護基を選択的に除去することによって達成できます。環化は、解離後の溶媒中または解離前の樹脂上で行うことができます。樹脂上のペプチドは環化立体構造を容易に形成しないため、樹脂上の環化は溶媒環化より効果が低い可能性があります。別のタイプの側鎖 - 側鎖環化は、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基と塩基アミノ酸の間のアミド構造の形成であり、これには側鎖保護基がポリペプチドから選択的に除去できなければなりません。樹脂上または解離後。3 番目のタイプの側鎖 - 側鎖環化は、チロシンまたは p-ヒドロキシフェニルグリシンによるジフェニル エーテルの形成です。天然物におけるこのタイプの環化は微生物産物でのみ見られ、環化産物には潜在的な薬効があることがよくあります。これらの化合物の調製には独特の反応条件が必要なため、従来のペプチドの合成ではあまり使用されません。
(2) ターミナルからサイドチェーンへ
末端側鎖環化には、通常、C 末端とリジンまたはオルニチン側鎖のアミノ基、または N 末端とアスパラギン酸またはグルタミン酸側鎖が含まれます。他のポリペプチドの環化は、末端 C とセリンまたはスレオニン側鎖の間にエーテル結合を形成することによって行われます。
(3) ターミナル型またはヘッドトゥテール型
鎖状ポリペプチドは、溶媒中で環化することも、側鎖環化によって樹脂上に固定することもできます。ペプチドのオリゴマー化を避けるために、溶媒集中化では低濃度のペプチドを使用する必要があります。頭から尾までの合成環状ポリペプチドの収量は、鎖状ポリペプチドの配列に依存します。したがって、環状ペプチドを大規模に調製する前に、まず鎖状リードペプチド候補のライブラリーを作成し、続いて環化して最良の結果が得られる配列を見つける必要があります。
2. N-メチル化
N-メチル化はもともと天然のペプチドで発生し、水素結合の形成を防ぐためにペプチド合成に導入され、それによってペプチドの生分解やクリアランスに対する耐性が高まります。N-メチル化アミノ酸誘導体を用いたペプチドの合成は最も重要な方法です。さらに、N-(2-ニトロベンゼンスルホニルクロリド)ポリペプチド樹脂中間体とメタノールとの光延反応も使用することができる。この方法は、N-メチル化アミノ酸を含む環状ペプチドライブラリーの調製に使用されています。
3. リン酸化
リン酸化は、自然界で最も一般的な翻訳後修飾の 1 つです。ヒトの細胞では、タンパク質の 30% 以上がリン酸化されています。リン酸化、特に可逆的リン酸化は、シグナル伝達、遺伝子発現、細胞周期と細胞骨格の調節、アポトーシスなどの多くの細胞プロセスの制御において重要な役割を果たします。
リン酸化はさまざまなアミノ酸残基で観察されますが、最も一般的なリン酸化の標的はセリン、スレオニン、チロシン残基です。ホスホチロシン、ホスホスレオニン、およびホスホセリン誘導体は、合成中にペプチドに導入することも、ペプチド合成後に形成することもできます。選択的リン酸化は、保護基を選択的に除去するセリン、スレオニン、チロシンの残基を使用して達成できます。一部のリン酸化試薬は、後修飾によってポリペプチドにリン酸基を導入することもできます。近年、リジンの部位特異的リン酸化は、化学的に選択的なシュタウディンガー亜リン酸反応を使用して達成されています (図 3)。
4. ミリストイル化とパルミトイル化
脂肪酸による N 末端のアシル化により、ペプチドまたはタンパク質が細胞膜に結合できるようになります。N 末端のミリダモイル化配列により、Src ファミリー プロテイン キナーゼおよび逆転写酵素 Gaq タンパク質が細胞膜に結合するよう標的化されることが可能になります。ミリスチン酸は、標準的なカップリング反応を使用して樹脂ポリペプチドの N 末端に結合され、得られたリポペプチドは標準的な条件下で解離し、RP-HPLC によって精製できました。
5. グリコシル化
バンコマイシンやテイコラニンなどの糖ペプチドは、薬剤耐性細菌感染症の治療に重要な抗生物質であり、他の糖ペプチドは免疫系を刺激するためによく使用されます。また、多くの微生物抗原は糖鎖付加されているため、感染症の治療効果を向上させるために糖ペプチドを研究することは非常に重要です。一方で、腫瘍細胞の細胞膜上のタンパク質は異常なグリコシル化を示すことが判明しており、そのため糖ペプチドはがんや腫瘍の免疫防御研究において重要な役割を果たしています。糖ペプチドはFmoc/t-Bu法により調製されます。スレオニンやセリンなどのグリコシル化残基は、グリコシル化アミノ酸を保護するために、ペンタフルオロフェノール エステルで活性化された fMOC によってポリペプチドに導入されることがよくあります。
6.イソプレン
イソペンタジエニル化は、C 末端近くの側鎖のシステイン残基で起こります。タンパク質イソプレンは細胞膜親和性を改善し、タンパク質間相互作用を形成します。イソペンタジエン化タンパク質には、チロシンホスファターゼ、低分子量 GTase、コシャペロン分子、核層、セントロメア結合タンパク質などがあります。イソプレンポリペプチドは、樹脂上のイソプレンを使用するか、システイン誘導体を導入することによって調製できます。
7. ポリエチレングリコール (PEG) 修飾
PEG 修飾は、タンパク質の加水分解安定性、生体内分布、ペプチドの溶解性を改善するために使用できます。ペプチドに PEG 鎖を導入すると、その薬理学的特性が改善され、タンパク質分解酵素によるペプチドの加水分解も阻害されます。PEG ペプチドは通常のペプチドよりも糸球体毛細血管の断面を容易に通過し、腎クリアランスを大幅に減少させます。インビボでのPEGペプチドの活性半減期が延長されているため、より少ない用量とより少ない頻度のペプチド薬剤で通常の治療レベルを維持できます。ただし、PEG 修飾にはマイナスの影響もあります。大量のPEGは酵素によるペプチドの分解を防ぎ、標的受容体へのペプチドの結合も減少させます。しかし、PEG ペプチドの親和性の低さは、通常、薬物動態学的半減期が長いことで相殺され、体内に長く存在することで、PEG ペプチドは標的組織に吸収される可能性が高くなります。したがって、最適な結果を得るには、PEG ポリマーの仕様を最適化する必要があります。一方、腎クリアランスの低下によりPEGペプチドが肝臓に蓄積し、高分子症候群を引き起こします。したがって、ペプチドを薬物試験に使用する場合は、PEG 修飾をより慎重に設計する必要があります。
PEG 修飾剤の一般的な修飾基は次のように大まかに要約できます: アミノ (-アミン) -NH2、アミノメチル-Ch2-NH2、ヒドロキシ-OH、カルボキシ-Cooh、スルフヒドリル (-チオール) -SH、マレイミド -MAL、炭酸スクシンイミド - SC、酢酸スクシンイミド -SCM、プロピオン酸スクシンイミド -SPA、n-ヒドロキシスクシンイミド -NHS、アクリレート-ch2ch2cooh、アルデヒド-CHO（プロピオナール-ald、ブチルALDなど）、アクリル塩基（-アクリレート-acrl）、アジド-アジド、ビオチニル -ビオチン、フルオレセイン、グルタリル-GA、アクリル酸ヒドラジド、アルキン-アルキン、p-トルエンスルホン酸-OT、コハク酸コハク酸イミド-SSなど。カルボン酸を有するPEG誘導体は、n末端アミンまたはリジン側鎖に結合できます。アミノ活性化PEGは、アスパラギン酸またはグルタミン酸側鎖に結合できます。Mal-活性化PEGは、完全に脱保護されたシステイン側鎖のメルカプタンに結合させることができます[11]。PEG 修飾剤は一般に次のように分類されます (注: mPEG はメトキシ-PEG、CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH です)。
(1) 直鎖PEG修飾剤
mPEG-SC、mPEG-SCM、mPEG-SPA、mPEG-OTs、mPEG-SH、mPEG-ALD、mPEG-butyrALD、mPEG-SS
(2) 二官能性PEG修飾剤
HCOO-PEG-COOH、NH2-PEG-NH2、OH-PEG-COOH、OH-PEG-NH2、HCl・NH2-PEG-COOH、MAL-PEG-NHS
(3) 分岐PEG修飾子
(mPEG)2-NHS、(mPEG)2-ALD、(mPEG)2-NH2、(mPEG)2-MAL
8. ビオチン化
ビオチンはアビジンやストレプトアビジンと強く結合することができ、その結合強度は共有結合に近いものもあります。ビオチン標識ペプチドは、イムノアッセイ、組織細胞化学、および蛍光ベースのフローサイトメトリーで一般的に使用されます。標識抗ビオチン抗体を使用して、ビオチン化ペプチドを結合することもできます。ビオチン標識は、多くの場合、リジン側鎖または N 末端に付加されます。6-アミノカプロン酸は、ペプチドとビオチンの間の結合としてよく使用されます。この結合は基材に柔軟に結合し、立体障害があるとよりよく結合します。
9. 蛍光標識
蛍光標識は、生細胞内のポリペプチドを追跡し、酵素と作用機序を研究するために使用できます。トリプトファン (Trp) は蛍光性があるため、固有の標識に使用できます。トリプトファンの発光スペクトルは周辺環境に依存し、溶媒の極性が低下すると減少します。この特性は、ペプチド構造や受容体結合の検出に役立ちます。トリプトファンの蛍光は、プロトン化されたアスパラギン酸およびグルタミン酸によって消光される可能性があるため、その使用が制限される可能性があります。塩化ダンシル基 (Dansyl) は、アミノ基に結合すると強い蛍光を発するため、アミノ酸やタンパク質の蛍光標識としてよく使用されます。
蛍光共鳴エネルギー変換 (FRET) は酵素の研究に役立ちます。FRETを適用する場合、基質ポリペプチドには通常、蛍光標識基と蛍光消光基が含まれています。標識された蛍光基は、非光子エネルギー移動を通じて消光剤によって消光されます。ペプチドが酵素から解離すると、標識基が蛍光を発します。
10. ケージポリペプチド
ケージペプチドは、ペプチドが受容体に結合するのを防ぐ光学的に除去可能な保護基を持っています。紫外線にさらされるとペプチドが活性化され、受容体に対する親和性が回復します。この光学的活性化は時間、振幅、または位置に従って制御できるため、ケージペプチドを使用して細胞内で起こる反応を研究できます。ケージポリペプチドに最も一般的に使用される保護基は、2-ニトロベンジル基およびその誘導体であり、保護アミノ酸誘導体を介してペプチド合成に導入できます。開発されているアミノ酸誘導体は、リジン、システイン、セリン、チロシンです。ただし、アスパラギン酸およびグルタミン酸誘導体は、ペプチド合成および解離中に環化を受けやすいため、一般的には使用されません。
11. ポリ抗原性ペプチド (MAP)
短いペプチドは通常免疫を持たないため、抗体を産生するにはキャリアタンパク質と結合する必要があります。ポリ抗原性ペプチド (MAP) は、リジン核に結合した複数の同一のペプチドで構成されており、強力な免疫原を特異的に発現でき、ペプチドとキャリアタンパク質の対の調製に使用できます。MAPポリペプチドは、MAP樹脂上の固相合成によって合成することができる。しかし、カップリングが不完全な場合、一部の分岐でペプチド鎖が欠落したり切断されたりするため、元の MAP ポリペプチドの特性が示されません。別の方法として、ペプチドを個別に調製および精製してから MAP に結合することもできます。ペプチドコアに結合したペプチド配列は明確に定義されており、質量分析によって容易に特徴付けられます。
結論
ペプチド修飾はペプチドを設計する重要な手段です。化学的に修飾されたペプチドは、高い生物学的活性を維持できるだけでなく、免疫原性や毒性の欠点を効果的に回避できます。同時に、化学修飾によりペプチドにいくつかの新しい優れた特性を与えることができます。近年、ポリペプチドの後修飾のためのCH活性化法が急速に開発され、多くの重要な成果が得られています。
投稿日時: 2023 年 3 月 20 日