FRETペプチド技術

蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)

蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) は、分子間電気対の相互作用を通じてドナー励起状態のエネルギーがアクセプター励起状態に移動する非放射エネルギー移動プロセスです。このプロセスには光子が関与しないため、非放射性です。このアッセイには、高速、高感度、簡単であるという利点があります。

FRET アッセイで使用される色素は同一であってもよい。しかし、ほとんどの用途では、実際には異なる染料が使用されます。簡単に言うと、発光共鳴エネルギーの移動は、ドナー基が励起されたときのドナー (色素 1) からアクセプター (色素 2) への双極子のペアの移動です。一般に、ドナーフルオロフォアグループの発光スペクトルは、アクセプターグループの吸収スペクトルと重複します。「2つの蛍光団間の距離が適切な場合（10〜100Å）、ドナーからアクセプターへの蛍光団エネルギーの移動が観察できます。」エネルギー伝達の方法は、受容体の化学構造によって異なります。

1. 分子振動に変換される、つまりエネルギー伝達の発光が消える。(受容体は光消光剤です)

2. 発光は受容体自体よりも強いため、二次蛍光スペクトルに赤方偏移が生じます。(受容体は発光体です)。

ドナーグループ（EDANS）とアクセプター遺伝子（DABCYL）はHIVプロテアーゼの天然基質に均一に結合しており、基質が切断されていない場合、DABCYLはEDANSをクエンリングしてフッ素を検出できなくなります。HIV-1 プロテアーゼが切断されると、EDANS は DABCYL によって消光されなくなり、その後 EDANS ルシフェラーゼが検出できるようになります。プロテアーゼ阻害剤の利用可能性は、EDANS の蛍光強度の変化によって監視できます。

FRET ペプチドは、ペプチダーゼの非特異性を研究するための便利なツールです。反応過程を継続的にモニタリングできるため、酵素活性を検出する簡便な方法となります。ドナー/アクセプターによるペプチド結合の加水分解後に生成される光沢は、ナノモル濃度での酵素活性の尺度を提供します。FRETペプチドが無傷である場合、内部フラッシュは突然消失しますが、ドナー/アクセプターの反対側のペプチド結合が切断されるとフラッシュが放出され、これを継続的に検出して酵素活性を定量化できます。